ANÁLISES INSTRUMENTAIS II

SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS

Processo que determina a ordem dos nucleotídeos de uma molécula de DNA. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.

1-) DEGRADAÇÃO QUÍMICA - MAXAM E GILBERT

O alvo deve ser marcado com compostos radioativos FOSFORO 32 (32P) - Decompondo a molécula marcada em pontos específicos - SEM ESPECIFICIDADE

2-) SANGER - DIDESOXI

Mais utilizado por sua SIMPLICIDADE também conhecido como TERMINADORES DE CADEIA OU SANGER

A síntese enzimática de uma fita complementar é INTERROMPIDA pela adição do DIDEOXINUCLEOTÍDEO (NUCLEOTÍDEO TERMINADOR).

METODOLOGIA

Consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo O ÚLTIMO NUCLEOTÍDEO  incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma MARCA que permita detectá-los na etapa de análises. 

SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS

A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA Polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma: dNTPs: dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com 32P sob a forma de análogo ddNTPs.

Estes análogos conhecidos como TERMINADORES quando incorporados à cadeia nascente bloqueará todo o processo.

Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente.

NÃO É UMA METODOLOGIA PRÁTICA, E É UMA TÉCNICA DEMORADA.

MODO AUTOMATIZADO

Através de maquinaria apropriada gerenciada por computadores com programas que têm sequencialmente e identificam os produtos.

Isto permite executar o processo em grande escala.

MARCADOR RADIOATIVO

É usado um marcador radiativo gerando um ALTO CUSTO.

- O analista precisa ter curso IPEM;

- O laboratório deve ter estrutura adequada para trabalhar com radioativo;

- O radioativo é ONCOGÊNICO), não é fácil de trabalhar;

- Precisa-se ter um descarte de lixo especial (LIXO RADIOATIVO).

MARCADOR FLUORECENTE

Utilizam-se 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) por fluorecência.

VANTAGENS: 

- pode-se usar cores diferentes;

- e realizar vários ao mesmo tempo.

Como cada reação (ATGC) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes, realizada em um único canal do gel de sequenciamento.

O sinal fluorecente tem um diferencial, emitindo por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda.

A luz emitida é detectada por "escaneamento" do gel e a sequência deduzida por computador.