COLORAÇÃO DE GRAM

COLORAÇÃO DE GRAM:

DEFINIÇÃO:

Os métodos de coloração são muito importantes em bacteriologia, pois facilitam a visualização das bactérias ao microscópio de luz. a coloração de gram separa as bactérias em duas classificações de acordo com a composição da parede celular.

Tanto a espessura da parede celular, quanto as dimensões dos espaços intersticiais, por exemplo, "diâmetro do poro", parecem ser determinantes do resultado final da coloração de Gram. Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares são cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do lugol, também chamado de mordente, ocorre a formação do completo iodo-pararosanilina. Esta reação tem a propriedade de fixar o

corante primário nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como álcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou não perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.

As bactérias que têm a parede celular composta por mureína (peptideoglicano - peptídeo de ácido n-acetil murâmico) (GRAM +), durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante. Já as bactérias com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas) (GRAM -), perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo.

INDICAÇÕES:

Microorganismos com parede celular gram negativas e gram positivas.

LIMITAÇÕES:

- microorganismos sem parede celular (Ex. micoplasmas)

- número de organismos baixo. Necessita-se de 104 organismos/mL no mínimo para a coloração de Gram.

COMO FAZER O CONTROLE DE QUALIDADE DO MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM?

O controle de qualidade é uma atividade obrigatória da rotina diária. Para realizar o controle de qualidade dos corantes e da coloração de Gram, você precisa de duas cepas bacterianas: a Gram-positiva deverá ser um Streptococcus pyogenes ATCC - American Type Culture Collection - nº 19.615 e a Gram-negativa deverá ser a Escherichia coli ATCC nº 25.922.

QUAIS AS DIFERENÇAS BIOQUÍMICAS ENTRE A SAFRANINA E A FUCSINA?

PROCEDIMENTO:

1- PREPARO DE ESFREGAÇO BACTERIANO:

1.1- A PARTIR DE COLÔNIAS BACTERIANAS:

- colocar uma gota de solução salina estéril na lâmina;

- tocar a colônia bacteriana com uma alça de níquel-cromo e homogeneizar o material da alça na gota de salina colocada da lâmina;

- distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um "filme" tênue e homogêneo (ESFREGAÇO);

- deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;

- fixar o esfregaço à lâmina passando esta por 3-5 vezes sobre a chama do bico de Bunsem;

1.2- A PARTIR DE CULTURAS EM MEIO LÍQUIDO:

- colocar uma "alçada" da cultura na lâmina;

- distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um "filme" tênue e homogêneo;

- deixar o ESFREGAÇO secar a temperatura ambiente;

- fixar o esfregaço à lâmina passando esta por 3-5 vezes sobre a chama do bico de Bunsem;

2- COLORAÇÃO DO ESFREGAÇO BACTERIANO PELO MÉTODO DE GRAM:

- cobrir o esfregaço com a Solução de Cristal Violeta por 1 minuto;

- desprezar o corante e lavar a lâmina com água corrente (não deixar que o jato de água incida diretamente sobre o esfregaço);

- cobrir o esfregaço com o Solução de Lugol (iodo + iodeto de potássio) por 1 minuto;

- desprezar o mordente e lavar a lâmina com água corrente;

- cobrir o esfregaço com o Solução Descorante por alguns segundos e desprezar;

- lavar a lâmina com água corrente*;

- cobrir o esfregaço com a Solução de Contra-Corante (safranina ou fucsina de Ziehl-Neelsen diluída 1/10) por 30 segundos;

- desprezar o contra-corante e lavar a lâmina com água corrente*;

- secar a lâmina e observar ao microscópio óptico com objetiva de imersão;

E COLI - GRAM NEGATIVO

STAPHYLOCOCCUS AUREUS - GRAM POSITIVA