SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS
Processo que determina a ordem dos nucleotídeos de uma molécula de DNA. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.
1-) DEGRADAÇÃO QUÍMICA - MAXAM E GILBERT
O alvo deve ser marcado com compostos radioativos FOSFORO 32 (32P) - Decompondo a molécula marcada em pontos específicos - SEM ESPECIFICIDADE
2-) SANGER - DIDESOXI
Mais utilizado por sua SIMPLICIDADE também conhecido como TERMINADORES DE CADEIA OU SANGER
A síntese enzimática de uma fita complementar é INTERROMPIDA pela adição do DIDEOXINUCLEOTÍDEO (NUCLEOTÍDEO TERMINADOR).
METODOLOGIA
Consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo O ÚLTIMO NUCLEOTÍDEO incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma MARCA que permita detectá-los na etapa de análises.
A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA Polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma: dNTPs: dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com 32P sob a forma de análogo ddNTPs.
Estes análogos conhecidos como TERMINADORES quando incorporados à cadeia nascente bloqueará todo o processo.
Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente.
NÃO É UMA METODOLOGIA PRÁTICA, E É UMA TÉCNICA DEMORADA.
MODO AUTOMATIZADO
Através de maquinaria apropriada gerenciada por computadores com programas que têm sequencialmente e identificam os produtos.
Isto permite executar o processo em grande escala.
MARCADOR RADIOATIVO
É usado um marcador radiativo gerando um ALTO CUSTO.
- O analista precisa ter curso IPEM;
- O laboratório deve ter estrutura adequada para trabalhar com radioativo;
- O radioativo é ONCOGÊNICO), não é fácil de trabalhar;
- Precisa-se ter um descarte de lixo especial (LIXO RADIOATIVO).
MARCADOR FLUORECENTE
Utilizam-se 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) por fluorecência.
VANTAGENS:
- pode-se usar cores diferentes;
- e realizar vários ao mesmo tempo.
Como cada reação (ATGC) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes, realizada em um único canal do gel de sequenciamento.
O sinal fluorecente tem um diferencial, emitindo por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda.
A luz emitida é detectada por "escaneamento" do gel e a sequência deduzida por computador.
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