PCR
Reação em cadeia da Polimerase consiste basicamente na amplificação sequencial de fragmentos de DNA PREDETERMINADOS e específicos "in vitro" de um determinado organismo.
Com a PCR, quantidades mínimas de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas, permitindo a detecção rápida de doenças infecciosas através e análises em uma simples eletroforese.
REVISÃO:
DNA - Ácido nucleico composto de duas cadeias antiparalelas complementares. Os nucleotídeos são compostos de um grupo de fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada.
ADENINA A = T TIMINA - 2 PONTES DE HIDROGÊNIO
CITOSINA C = G GUANINA - 3 PONTES DE HIDROGÊNIO
O PCR é uma técnica que amplifica uma sequência especifica de DNA com o objetivo de torná-la abundante e disponível para DIVERSAS TÉCNICAS de biologia molecular.
Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que planqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada a qual pode ser um gene inteiro ou parte dele.
DEFINIÇÕES:
DNA POLIMERASE - enzima
NUCLEOTÍDEOS - monômeros de DNA/RNA
PRIMER - oligonucleotídeos ( aproximadamente 15 a 30 nucleotídeos)
PRINCÍPIO DA TÉCNICA
- DENATURAÇÃO
- ANELAMENTO
- POLIMERIZAÇÃO
MATERIAL
- DNA alvo (template);
- DNA Polimerase;
- Nucleotídeos (DNTP);
- Primer;
- Mg;
- Solução Tampão.
TÉCNICA
PRIMEIRA FASE - DENATURAÇÃO
A dupla fita do DNA da amostra sofre denaturação a temperaturas acima de 94º, gerando duas moléculas de DNA fita simples.
SEGUNDA FASE - ANELAMENTO
Nas 2ª fase 2 primers diferentes hibridizam com sua sequência complementar, localizada em cada uma das fitas de DNA.
TERCEIRA FASE - ALONGAMENTO
Nesta fase a enzima TAQ Polimerase catalisa a adição de nucleotídeos presentes na solução dois primers hibridizados, a uma temperatura de 72º
APLICAÇÕES:
- Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas;
- Amplificação dos genes para posterior clonagem e expressão;
- Determinação de variabilidade genética;
- Determinação de OGMs;
- Sexagem de embriões;
- Estudo de expressão gênica.
VANTAGENS:
- Sensibilidade analítica;
- Detecta organismos que não podem ser isolados;
- Rapidez;
- Versatilidade de amostras.
DESVANTAGENS:
- Contaminação;
- Reprodutibilidade;
- Em alguns casos pouca correlação clínica;
TIPOS DE PCR
1-) RT PCR
Está baseada no processo de transcrição reversa seguida de amplificação. Esta técnica permite a formação de CDNA (DNA complementar) a partir do mRNA. FAZ-SE A ANALISE DE FENÓTIPO, é um modo preventivo não eficaz, pois não consegue identificar a célula alterada.
Níveis mais alto de sensibilidade são atingidos e o risco de contaminação é menor.
2-) NESTED PCR
O segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo sequências localizadas fora dela e, utilizando-se este primeiro produto, segue-se a amplificação da real sequência alvo. Estas duas etapas podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente. Precisa-se de 4 primers para especificar.
PCR - REAL TIME
Amplificação convencional, baseado DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO sinal fluorecente ao longo dos ciclos. SYBERGREEN/OLIGONUCLEOTÍDEOS marcado com REPORTER (emite fluorecente) QUENCHER (absorve fluorecente). É adicionado no final de cada ciclo é emitido um sinal fluorecente que é capturado por um sistema óptico e convertido em um gráfico de amplificação.
TÉCNICA QUANTITATIVA
VANTAGENS
- Acompanhamento da reação em tempo real
- Resultados mais rápidos e precisos
- Sistema informatizado
- Permite a detecção de mais de um DNA alvo
- Menor risco de contaminação
- Facilidade quantificação.
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