ANÁLISES INSTRUMENTAL II

SOUTHERN BLOTTING

O método foi batizado com o nome de seu inventor, o biólogo Edwin Southern, e isso fez com que outros métodos de Blot fossem batizados com trocadilhos ao nome de SOUTHERN, por exemplo WESTERN BLOT e NORTHERN BLOT.

Essa técnica permite a visualização de fragmentos de DNA que compõem um genoma complexo. Nessa técnica, o DNA genômico é dirigido por uma ou mais enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são separados por eletroforese.

Os fragmentos de DNA são transferidos do gel para uma membrana de nitrocelulose e a seguir expostos a uma solução contendo uma sonda marcada com RADIOATIVO, quimioluminescente ou com fluorcromo.

Para que ocorra a hibridização, esta sonda deverá ser composto de uma molécula de ácido nucleico de fita SIMPLES, que seja complementar em sequencia ao fragmento alvo.

TÉCNICA DE SOUTHERN BLOTTING

NORTHERN BLOTTING

Essa técnica utiliza o princípio da técnica de SOUTHERN BLOT, entretanto não para detectar um segmento específico de DNA, mas um fragmento de uma MOLÉCULA DE RNA, sendo amplamente utilizada para verificar expressão celular.

NORTHERN BLOT

WESTERN BLOT

Esta técnica permite a visualização de PROTEÍNAS. É um método em que as proteínas, são separadas por ELETROFORESE em gel de poliacrilamida em presença de SDS (ALTERAR AS CARGAS DA PROTEÍNA) e posteriormente transferida eletroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose.

As membranas de nitrocelulose adsorvem proteínas com grande eficiência sendo muito úteis em ensaios QUANTITATIVOS.

A identificação imunológica das frações separadas e transferidas é feita imergindo as tiras de nitrocelulose em solução contendo anticorpos específicos para as frações. Os anticorpos se ligam as frações e são revelados usando uma anti imunoglobulina marcada com uma enzima, para a visualização utiliza-se um CROMOGENO que sob a ação enzimática fornece cor.

TÉCNICA DE WESTERN BLOT

ANÁLISES INSTRUMENTAIS II

SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS

Processo que determina a ordem dos nucleotídeos de uma molécula de DNA. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.

1-) DEGRADAÇÃO QUÍMICA - MAXAM E GILBERT

O alvo deve ser marcado com compostos radioativos FOSFORO 32 (32P) - Decompondo a molécula marcada em pontos específicos - SEM ESPECIFICIDADE

2-) SANGER - DIDESOXI

Mais utilizado por sua SIMPLICIDADE também conhecido como TERMINADORES DE CADEIA OU SANGER

A síntese enzimática de uma fita complementar é INTERROMPIDA pela adição do DIDEOXINUCLEOTÍDEO (NUCLEOTÍDEO TERMINADOR).

METODOLOGIA

Consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo O ÚLTIMO NUCLEOTÍDEO  incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma MARCA que permita detectá-los na etapa de análises. 

SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS

A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA Polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma: dNTPs: dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com 32P sob a forma de análogo ddNTPs.

Estes análogos conhecidos como TERMINADORES quando incorporados à cadeia nascente bloqueará todo o processo.

Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente.

NÃO É UMA METODOLOGIA PRÁTICA, E É UMA TÉCNICA DEMORADA.

MODO AUTOMATIZADO

Através de maquinaria apropriada gerenciada por computadores com programas que têm sequencialmente e identificam os produtos.

Isto permite executar o processo em grande escala.

MARCADOR RADIOATIVO

É usado um marcador radiativo gerando um ALTO CUSTO.

- O analista precisa ter curso IPEM;

- O laboratório deve ter estrutura adequada para trabalhar com radioativo;

- O radioativo é ONCOGÊNICO), não é fácil de trabalhar;

- Precisa-se ter um descarte de lixo especial (LIXO RADIOATIVO).

MARCADOR FLUORECENTE

Utilizam-se 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) por fluorecência.

VANTAGENS: 

- pode-se usar cores diferentes;

- e realizar vários ao mesmo tempo.

Como cada reação (ATGC) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes, realizada em um único canal do gel de sequenciamento.

O sinal fluorecente tem um diferencial, emitindo por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda.

A luz emitida é detectada por "escaneamento" do gel e a sequência deduzida por computador.

ANÁLISES INSTRUMENTAL II

PCR

Reação em cadeia da Polimerase consiste basicamente na amplificação sequencial de fragmentos de DNA PREDETERMINADOS e específicos "in vitro" de um determinado organismo.

Com a PCR, quantidades mínimas de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas, permitindo a detecção rápida de doenças infecciosas através e análises em uma simples eletroforese.

REVISÃO:

DNA - Ácido nucleico composto de duas cadeias antiparalelas complementares. Os nucleotídeos são compostos de um grupo de fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada.

ADENINA      A = T     TIMINA  -     2 PONTES DE HIDROGÊNIO

CITOSINA     C = G     GUANINA -  3 PONTES DE HIDROGÊNIO

DNA

O PCR é uma técnica que amplifica uma sequência especifica de DNA com o objetivo de torná-la abundante e disponível para DIVERSAS TÉCNICAS de biologia molecular.

Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que planqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada a qual pode ser um gene inteiro ou parte dele.

DEFINIÇÕES:

DNA POLIMERASE - enzima

NUCLEOTÍDEOS - monômeros de DNA/RNA

PRIMER - oligonucleotídeos ( aproximadamente 15 a 30 nucleotídeos)

DNA POLIMERASE, PRIMER

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

- DENATURAÇÃO

- ANELAMENTO

- POLIMERIZAÇÃO

MATERIAL

- DNA alvo (template);

- DNA Polimerase;

- Nucleotídeos (DNTP);

- Primer;

- Mg;

- Solução Tampão.

TÉCNICA

PRIMEIRA FASE - DENATURAÇÃO

A dupla fita do DNA da amostra sofre denaturação a temperaturas acima de 94º, gerando duas moléculas de DNA fita simples.

SEGUNDA FASE - ANELAMENTO

Nas 2ª fase 2 primers diferentes hibridizam com sua sequência complementar, localizada em cada uma das fitas de DNA.

TERCEIRA FASE - ALONGAMENTO

Nesta fase a enzima TAQ Polimerase catalisa a adição de nucleotídeos presentes na solução dois primers hibridizados, a uma temperatura de 72º

FASES PCR

APLICAÇÕES:


- Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas;
- Amplificação dos genes para posterior clonagem e expressão;
- Determinação de variabilidade genética;
- Determinação de OGMs;
- Sexagem de embriões;
- Estudo de expressão gênica.

TERMOCICLADOR PCR

VANTAGENS:

- Sensibilidade analítica;

- Detecta organismos que não podem ser isolados;

- Rapidez;

- Versatilidade de amostras.

DESVANTAGENS:

- Contaminação;

- Reprodutibilidade;

- Em alguns casos pouca correlação clínica;

TIPOS DE PCR

1-) RT PCR

Está baseada no processo de transcrição reversa seguida de amplificação. Esta técnica permite a formação de CDNA (DNA complementar) a partir do mRNA. FAZ-SE A ANALISE DE FENÓTIPO, é um modo preventivo não eficaz, pois não consegue identificar a célula alterada. 

Níveis mais alto de sensibilidade são atingidos e o risco de contaminação é menor.

RT PCR

2-) NESTED PCR

O segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo sequências localizadas fora dela e, utilizando-se este primeiro produto, segue-se a amplificação da real sequência alvo. Estas duas etapas podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente. Precisa-se de 4 primers para especificar.

PCR - REAL TIME

Amplificação convencional, baseado DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO sinal fluorecente ao longo dos ciclos. SYBERGREEN/OLIGONUCLEOTÍDEOS marcado com REPORTER (emite fluorecente)  QUENCHER (absorve fluorecente). É adicionado no final de cada ciclo é emitido um sinal fluorecente que é capturado por um sistema óptico e convertido em um gráfico de amplificação.

TÉCNICA QUANTITATIVA

VANTAGENS

- Acompanhamento da reação em tempo real

- Resultados mais rápidos e precisos

- Sistema informatizado

- Permite a detecção de mais de um DNA alvo

- Menor risco de contaminação

- Facilidade quantificação.