IMUNOLOGIA II

IMUNODEFICIÊNCIA
É um estado de insuficiência imunológica que leva a um aumento no risco e desenvolver infecções e neoplasias.

PACIENTES COM IMUNODEFICIÊNCIA:

- Tem mais infecções do que indivíduos normais, podendo apresentar várias infecções ao mesmo tempo;

- Infecções tendem a ser crônicas:

- Infecções oportunistas

CAUSAS IMUNODEFICIÊNCIA

- IMUNODEFICIÊNCIAS PRIMÁRIAS

Tem uma base genética, causada por mutações nos genes do sistema imunológico, são raras e causam infecções graves nos primeiro anos de vida.

- IMUNODEFICIÊNCIAS SECUNDÁRIAS

Problemas adquiridos durante a vida EXPOSIÇÃO ALGUM COMPONENTE, MEDICAMENTOS, VÍRUS (HIV).

DOENÇAS DA IMUNODEFICIÊNCIA

1-) AGAMAGLOBULINEMIA LIGADA AO X

Hereditária. É a falta de capacidade dos doentes em PRODUZIR ANTICORPOS, OS LINFÓCITOS B NÃO PRODUZ IMUNOGLOBULINA.

CLÍNICA: Aumento infecções mucosas IgA, se for para a corrente sanguínea atinge outros órgãos.

DIAGNÓSTICO: Não há aumento de LINFONODOS, BTK, ZERO DE IMUNOGLOBULINAS

TRATAMENTO: Antibiótico, imunoglobulina

OBS.: NENHUM INDIVÍDUO DEVE SER VACINADO SE ESTIVER COM NÍVEL DE ANTICORPOS BAIXO.

2-) DOENÇA GRANULOMATOSA CRÔNICA (FORMAÇÃO DE GRANULOMAS)

Incapacidade das células fagocitárias (NEUTRÓFILOS) de produzir PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

CLÍNICA: Aumento infecções bacterianas e fúngicas

DIAGNÓSTICO: Teste in vitro - VERIFICAÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

TRATAMENTO: Antibiótico e VACINAS DESDE QUE SEJA MICRO-ORGANISMOS INATIVOS, PARTICULADOS, MORTOS

3-) IMUNODEFICIÊNCIA COMBINADA GRAVE

Síndrome rara e fatal com diversas causas genéticas - AUSÊNCIA LINFÓCITO T, B E NATURAL KILLER

CLÍNICA: Aumento infecções

DIAGNÓSTICO: Leucograma, REDUÇÃO QUASE A ZERO

TRATAMENTO: Antibiótico, isolamento, imunoglobulina, transplante de medula

4-) IMUNO COMUM VARIÁVEL

Caracterizada por NÍVEIS BAIXOS DE IMUNOGLOBULINAS SÉRICAS e aumento susceptibilidade infecções NÃO SE SABE A CAUSA EXATA

CLÍNICA: Bronquietasias (aumento pneumonias), aumento gânglios linfáticos, auto anticorpos

DIAGNÓSTICO: Diminuição de Imunoglobulinas

TRATAMENTO: Antibióticos e soroterapia

5-) SÍNDROME DE HIPER IgM

Incapacidade produção de IgG, IgA e IgE. Interação LTCD4, diminuição leucócitos, infecção inferior das vias aéreas devido a FALTA DE IgA, bactérias.

DIAGNÓSTICO: Mutação gênica, diminuição IgG, IgA e IgE, IgM normal ou alterado

TRATAMENTO: Soroterapia, IgG, fator estimulante de colônia, transplante de medula óssea.

6-) SÍNDROME DE WISKOTT-ALDRICH

Envolve imunodeficiência LT, LB e plaquetas.

CLÍNICA: Aumento de sangramentos devido a plaquetas serem pequenas, aumento de infecções bacterianas e fúngicas, tumores (linfoma/leucemia)

DIAGNÓSTICO: Mutação (PSWA), diminuição do tamanho e quantidade de plaquetas, fração LT anormal.

TRATAMENTO: Transplante de medula, administração plaquetas, IgG, soroterapia, antibióticos.

7-) HIPOGAMAGLOBULINEMIA TRANSITÓRIA DA INFÂNCIA

Bebês apresentam concentrações baixas Ig dos 3 aos 6 meses de vida. Geralmente acomete PREMATUROS, CRIANÇAS DE 6 A 18 MESES DE VIDA.

DIAGNÓSTICO: Clínico, aumento de infecção

TRATAMENTO: Não há necessidade, apenas medidas preventivas

8-) SÍNDROME DIGEORGE

Desenvolvimento anormal do feto. 

CLÍNICA:  Feto nasce sem o timo, deficiência da maturação dos linfócitos T.

DIAGNÓSTICO: RX para detectar a ausência do timo

TRATAMENTO: Antibióticos

GERALMENTE NÃO SOBREVIVEM JÁ QUE POSSUEM OUTRAS ALTERAÇÕES.

IMUNODEFICIÊNCIAS ADQUIRIDAS

Adquiridas durante a vida (FATORES EXTERNOS)

EX.: 

- INFECÇÃO DO VÍRUS DA IMUNO DEFICIÊNCIA HUMANA (HIV) Permanente

- INFECÇÃO DO VÍRUS DA RUBÉOLA - Temporário

- DESNUTRIÇÃO PROTEÍCO-CALÓRICA - Inibe a maturação e função dos linfócitos

- TRATAMENTO COM RADIAÇÃO E QUIMIOTERAPIA

- REMOÇÃO DO BAÇO

SÍNDROME IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA

HISTÓRICO:

1977/1978 - Primeiros casos nos EUA, Haiti e África Central, descobertos e definidos como AIDS em 1982, quando se classificou a nova síndrome.

1980 - 1º CASO NO BRASIL (sem saber exatamente o que era)

1982 - Adoção temporária do nome da doença dos 5H (homossexuais, hemofílicos, haitianos, heroinômanos e hookers)

- Conhecimento transmissão

- 1º caso de corrente de transfusão sanguínea

1983 - Outras pessoas fora dos grupos de riscos contraíram (crianças, heterossexuais, profissionais da saúde, mulheres

1984 - Instituto Pasteur isola o vírus

1º PROGRAMA DE CONTROLE AIDS BRASIL

1985 - 1º Diagnóstico (TESTE DIAGNÓSTICO), comportamento de risco (PROMISCUIDADE, SEXO SEM PROTEÇÃO DE BARREIRA)

AIDS FASE FINAL

1987 - AZT - 2.775 casos no Brasil

1988 - SUS - 4.535 Casos no Brasil

1992 -  DROGAS COMBINADAS, cofator de transmissão (18x),  14.924 casos

1994 - AZT - GESTANTE

1996 - Medicamento gratuito, menor mortalidade 22.343, aumento em mulheres

1997 - CD4/ cargo viral

2002 - 258.000 casos no Brasil

2006 - Menor transmissão vertical 50%

2009 - Apesar dos programas do governo os casos aumentaram para 544.000, sendo em maior número os adolescentes e os idosos.

DESCRIÇÃO CLÍNICA DA DOENÇA 1981
ISOLAMENTO 1982
AZT 1987 
HAART 1996
Terapia anti-retroviral altamente ativa.

RETROVÍRUS - TCD4+ (RECEPTOR CD4+) MACRÓFAGOS E CÉLULAS DENDRÍTICAS (QUIMIOCINAS CXCR4 E CCS)
ENZIMAS: Transcriptase reversa, protease, integrase
PRINCIPAL GLICOPROTEÍNAS DO ENVELOPE gp120 (proteína modificada pelo vírus.
2 TIPOS: HIV1 HIV2

TENDÊNCIAS NA TRANSMISSÃO:
- diminuição vertical
- aumento entre jovens e idosos

3 FASES DA INFECÇÃO


- FASE INICIAL: marcada por uma infecção aguda, controlada parcialmente pela imunidade adquirida.
- FASE LATENTE: linfonodo e baço passam a ser locais de contínua replicação viral.
- FASE FINAL: diminui TCD4, aumento infecções oportunistas

MECANISMOS ENVOLVIDOS NA IMUNODEFICIÊNCIA
- diminuição CD4+ (1500 - 200mm³)
- deficiência na ativação LTCD8+
- macrófagos e dendríticas: diminuição apresentação
- diminuição MHC classe I

LINFOMA E SARCOMA DE KAPOSI


- Mecanismo de escape
- Capacidade mutogênica (Transcriptase reversa, gp 120)
- Inibição celular
- pró-vírus

DIAGNÓSTICO:
Elisa (triagem), Western Blot (confirmatório), teste rápido AC (urgência)

TRATAMENTO
- Bloqueio entrada viral.

IMUNOLOGIA II

HIPERSENSIBILIDADE

Inflamação excessiva causada pelo sistema imunológico. DISTÚRBIOS CAUSADOS PELAS RESPOSTAS IMUNES (EXAGERADA OU INADEQUADA), culminando em DOENÇAS DA HIPERSENSIBILIDADE.

TIPOS:

AGENTES ESTRANHOS: Desregulados ou não controlados (pólen, poeira, fármacos).

AGENTES PRÓPRIOS (AUTÓLOGOS): Doenças auto-imunes.

CLASSIFICAÇÃO

São classificados com base no mecanismo imunológico principal RESPONSÁVEL PELA LESÃO TECIDUAL E A DOENÇA.

TIPO I - HIPERSENSIBILIDADE IMEDIATA

Reação rápida da musculatura lisa e vascular. Sintomas iniciam de 5 a 30 minutos após o contato com antígeno. Mediada por IgE ligadas aos mastócitos (PROCESSOS ALÉRGICOS).

O ANTICORPO IgE É INDUZIDO PELO ALÉRGENO E LIGA-SE A MASTÓCITOS E BASÓFILOS. EM UMA NOVA EXPOSIÇÃO AO ALÉRGENO, O ALÉRGENO PROMOVE A LIGAÇÃO CRUZADA DAS IgES, INDUZINDO A DEGRANULAÇÃO E LIBERAÇÃO DE MEIADORES (HISTAMINAS, CITOCINAS, AMINAS VASOATIVAS).

HIPERSENSIBILIDADE TIPO I

PRINCIPAIS MEDIADORES

- AMINAS VASOATIVOS: Dilatação muscular, contração músculo liso

- PROTEASES: Danos tecidual

- PROSTAGLANDINAS: Dilatação vascular

- LEUCOTIENOS: Contração músculo liso

- CITOCINA: Inflamação

FASE IMEDIATA

Vasodilatação capilar, espasmos das células, músculos lisos, secreção glandular

FASE TARDIA

Infiltração de EOSINÓFILOS, BASÓFILOS, NEUTRÓFILOS, MONÓCITOS podendo haver dano tecidual.

ANAFILAXIA SISTÊMICO

Exposição de alguns alérgenos por via oral ou subcutânea, disseminam pela corrente sanguínea ativando MASTÓCITOS próximos dos vasos sanguíneos - gerando uma ATIVAÇÃO GENERALIZADA DOS MASTÓCITOS.

CLÍNICO:

-CORAÇÃO E SISTEMA VASCULAR:

Maior permeabilidade capilar, edema tecidual, diminuição pressão arterial, diminuição O2, batimentos cardíacos irregulares, perda da consciência.

- TRATO RESPIRATÓRIO:

Contração músculo liso, constrição da garganta (edema de glote)

- TRATO GASTRO INTESTINAL:

Cólicas estomacais, vômito, diarreia.

HIPERSENSIBILIDADE TIPO II - MEDIADA POR ANTICORPOS

Anticorpos IgM e IgG pré-formados contra componentes celulares medeiam essas reações. Forma comum de doença imunológica crônica. Ativa o SISTEMA COMPLEMENTO.

Podendo ser: 

- ESPECÍFICA

- SISTÊMICA (vasculite, artrite, nefrite)

TIPOS

- ALOIMUNOLOGIA

Reações transfuncionais GRUPO SANGUÍNEOS ABO

Incompatibilidade Rh

- AUTO-IMUNOLOGIA

- MEDICAMENTOSA -  Anticorpo - lesão - inflamação - função alterada

HIPERSENSIBILIDADE TIPO III - IMUNO-COMPLEXOS

GLOMERULITE - Complexos depositados nos rins.

HIPERSENSIBILIDADE TIPO IV - HIPERSENSIBILIDADE TARDIA

DERMATITE DE CONTATO - Resposta celular

IMUNOLOGIA II

TOLERÂNCIA IMUNOLÓGICA


CONCEITO: 

É a incapacidade específica adquirida (total ou parcial) por um indivíduo a desenvolver uma resposta imune HUMORAL NORMAL ou a MEDIAÇÃO CELULAR a um antígeno ou a diversos epítopos de um certo antígeno contra o qual ele normalmente se desenvolveria uma resposta em outras condições.

PROCESSO:

Processo ativamente adquirido no qual os linfócitos potencialmente auto reativos são eliminados (DELEÇÃO CLONAL) ou tornados afuncionais (ANERGIA CLONAL) após contato com os auto-antígenos;

- TOLERÂNCIA CENTRAL;

- TOLERÂNCIA PERIFÉRICA.

ASPECTOS IMUNOLÓGICOS DA AUTO-TOLERÂNCIA

Tolerância é diferente da imunossupressão não específica e imunodeficiência.

É um processo ativo antígeno-dependente em resposta ao antígeno.

- É específica;

- Pode existir em células T, células B ou em ambas;

- Tolerância ao nível da célula T é mais duradoura do que a tolerância ao nível de célula B.

DELEÇÃO CLONAL

Linfócitos T e B durante o desenvolvimento encontram antígenos próprios e tais células realizam a deleção clonal através de um processo conhecido coo apoptose ou morte celular programada.

EX.: MATURAÇÃO DAS LT NO TIMO.

ANERGIA CLONAL

Células T auto-reativas quando expostas a peptídeos antigênicos em células apresentadoras de antígenos (APC) que não possuem as moléculas co-estimulatórias.

Também, células B quando expostas a grandes quantidades de antígeno solúvel regula negativamente sua IgM e se torna anérgica. Essas células também regulam positivamente as moléculas. Fas na sua superfície. Uma interação dessas células B com células T carreando ligantes Fas resultam na sua morte via apoptose.

IGNORÂNCIA CLONAL

Células T reativas a antígenos próprios não representadas no timo irão maturar e migrar para a periferia, mas elas certamente não irão encontrar jamais o antígeno apropriado porque este está sequestrado em tecidos inacessíveis. Tais células deverão morrer por falta de estímulos. Células B auto-reativas, que escapam da deleção, podem não encontrar o antígeno ou a ajuda da célula T específica e assim não será ativada e morrerá.

AUTOIMUNIDADE

A autoimunidade ocorre quando os anticorpos e as células T reconhecem componentes normais no corpo. As respostas autoimunes podem às vezes, mas nem sempre, causar doenças. A DOENÇA AUTOIMUNE é mediada pelas reações de hipersensibilidade dos tipos 2, 3 e 4.

DOENÇAS DA AUTOIMUNIDADE

DOENÇA CELÍACA

Também conhecida como ESPRU CELÍACO/ ENTEROPATIA POR GLÚTEN. 

É um distúrbio no intestino delgado, com má absorção e intolerância ao glúten (gliadina) encontrada principalmente em grãos de trigo, cevada e centeio.

A doença causa ATROFIA das vilosidades da mucosa do intestino delgado.

CAUSAS: predisposição genética, falta de enzima digestiva e FORMAÇÃO DE ANTICORPOS.

Associação com HLA-B8, DR3, DR7.

MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS: diarreia, distensão abdominal dolorosa, fezes gordurosas e perda de peso.

A doença é muito comum, afetando aproximadamente 1% das populações, embora seja significativamente não diagnosticada, já que a maioria dos portadores ela causa sintomas mínimos ou ausentes. Ocorre mais comumente em mulheres, na proporção de 2:1, e é mais comum em parentes de primeiro grau de portadores.

MECANISMO DE AÇÃO: GLIADINA É O ANTÍGENO QUE ESTIMULA UM ATAQUE DE CÉLULAS T CITOTÓXICAS

ANEMIA PERNICIOSA

Deficiência de VITAMINA B12 em decorrência da má-absorção.

Reações autoimunes dirigias contra as células parietais gástricas e seus produtos.

MECANISMO DE AÇÃO: 90% DEFICIÊNCIA ABSORÇÃO OCORRE POR ANTICORPOS ANTI-FATOR INTRÍNSECO PRODUZIDO NO ESTÔMAGO.

DOENÇAS DE GRAVES

Hipertireoidismo, oftalmopatia e dermopatia inflitrativa. 

MECANISMO DE AÇÃO: ANTICORPOS QUE RECONHECEM O HORMÔNIO ESTIMULADOR DA TIREÓIDE (TSH) MIMETIZANDO-O, O QUE LEVA À ATIVAÇÃO CONTÍNUA DA TIREÓIDE, AUMENTO DE T3, T4 E REDUÇÃO DO TSH.

É uma doença autoimune em que os anticorpos se ligam aos receptores de membrana do TSH ou seja os anticorpos induzem a ativação contínua de secreção dos hormônios pela glândula tireóidea, os anticorpos fazem o papel do hormônio estimulantes TSH. Os anticorpos que provocam hipertireoidismo quase sempre são produzidos em consequência de autoimunidade contra o tecido tireóideo.

60 - 80% dos hipertireoidismo femininos. 

MIASTENIA GRAVIS

Funcionamento anormal da junção neuromuscular (FRAQUEZA MUSCULAR).

MECANISMO DE AÇÃO: ANTICORPOS ATACAM OS RECEPTORES NO LADO MUSCULAR DE JUNÇÃO NEUROMUSCULAR - aqueles que recebem sinal nervoso da ACETILCOLINA.

MÚSCULOS MAIS SUSCEPTÍVEIS - nervos cranianos, 50% músculos oculares.

Pode surgir após EVENTO ESTRESSANTE (infeção e anestesia).

ARTRITE REUMATÓIDE

É uma doença autoimune sistêmica, caracterizada pela INFLAMAÇÃO CRÔNICA, das articulações sinoviais com destruição progressiva de estruturas cartilaginosas e ósseas.

LINFÓCITOS B DAS MEMBRANAS SINOVIAIS PRODUZEM ANTICORPOS (IgM) CONTRA A PORÇÃO FC DA IgG PRODUZIDAS CONTRA INFECÇÕES OU RESPOSTAS INFLAMATÓRIAS.

É uma doença que acomete mais os indivíduos do sexo feminino (de 3 a  vezes mais do que os do sexo masculino). E tem seu pico e incidência entre 35 a 55 anos.

POSSÍVEIS CAUSAS: 

- Fatores hormonais (3:1 em mulheres);

- Agentes infecciosos como MYCOPLASMA, VÍRUS DA RUBÉOLA, CMV, HERPES, PARVOVÍRUS B19, EBV E MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

- Presença de MHC-H, HLA-DR4 e DR1.

MECANISMO DE AÇÃO: LÍQUIDO SINOVIAL FICA CHEIO DE NEUTRÓFILOS, MACRÓFAGOS, LTh-1 E CÉLULAS DENDRÍTICAS.

PRODUÇÃO DE METALOPROTEÍNASES PELOS MACRÓFAGOS ATIVADOS POR il-1 E TNF- ALFA, CLIVANDO COLÁGENO E PROTEOGLICANOS.

LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO
Doença crônica e multi sistêmica.
Desenvolve-se em: FATORES GENÉTICOS (HLA DR3), DEFICIÊNCIA DE C2 E C4, FATORES HORMONAIS, FATORES AMBIENTAIS (exposição UvB e medicamentos como PROCAINAMIDA, HIDRALAZINA, CLORPROMAZINA, ISONIAZINAS, PRACTOLOL E METILDOPA.
MECANISMO DE AÇÃO: ANTICORPOS AUTO-REATIVOS CONTRA CONSTITUÍNTES NUCLEARES: DNA, RIBONUCLEOPROTEÍNAS, HISTONAS, ANTÍGENOS DE NUCLÉOLOS.
COMPLEXOS IMUNES se depositam nos GLOMÉRULOS RENAIS, ARTICULAÇÕES, PELE E VASOS SANGUÍNEOS.
É tratável apenas sintomaticamente com CORTICOSTERÓIDES E IMUNOSSUPRESSORES.


DIABETES INSULINO DEPENDENTE
Diabetes tipo I, presença de anto-anticorpos:
ANTI-GAD: Contra uma enzima DECARBOSILASE DO ÁCIDO GLUTÂMICO (GAD), participa da biossíntese de um neurotransmissor (GABA), e nas CÉLULAS PANCREÁTICAS.
ANTI-ILHOTA OU ICA: Marcador de DM Tipo I. A presença deste anticorpo é sinal da atividade da doença.
ANTI-INSULINA: Anticorpo anti-insulina pode ocorrer de forma espontânea ou após uso de insulina.

ESCLEROSE MÚLTIPLA
Mais grave onde CÉLULAS T AUTO-REATIVAS E MACRÓFAGOS ATIVADOS CAUSAM DEMIELIZAÇÃO DA SUBSTÂNCIA BRANCA CEREBRAL.
Acredita-se que o fator desencadeante estimulador seja uma infecção viral.
O óbito acontece em pouco tempo, se não diagnosticado precocemente.
SINAIS E SINTOMAS: 
- Dor facial;
- Dormência;
- Vertigem;
- Falta de coordenação;
- Dor nos braços;
- Desequilíbrio;
- Perda de visão e audição.
Não possui tratamento, somente imunossupressores e anti-inflamatórios.

ANÁLISES INSTRUMENTAL II

SOUTHERN BLOTTING

O método foi batizado com o nome de seu inventor, o biólogo Edwin Southern, e isso fez com que outros métodos de Blot fossem batizados com trocadilhos ao nome de SOUTHERN, por exemplo WESTERN BLOT e NORTHERN BLOT.

Essa técnica permite a visualização de fragmentos de DNA que compõem um genoma complexo. Nessa técnica, o DNA genômico é dirigido por uma ou mais enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são separados por eletroforese.

Os fragmentos de DNA são transferidos do gel para uma membrana de nitrocelulose e a seguir expostos a uma solução contendo uma sonda marcada com RADIOATIVO, quimioluminescente ou com fluorcromo.

Para que ocorra a hibridização, esta sonda deverá ser composto de uma molécula de ácido nucleico de fita SIMPLES, que seja complementar em sequencia ao fragmento alvo.

TÉCNICA DE SOUTHERN BLOTTING

NORTHERN BLOTTING

Essa técnica utiliza o princípio da técnica de SOUTHERN BLOT, entretanto não para detectar um segmento específico de DNA, mas um fragmento de uma MOLÉCULA DE RNA, sendo amplamente utilizada para verificar expressão celular.

NORTHERN BLOT

WESTERN BLOT

Esta técnica permite a visualização de PROTEÍNAS. É um método em que as proteínas, são separadas por ELETROFORESE em gel de poliacrilamida em presença de SDS (ALTERAR AS CARGAS DA PROTEÍNA) e posteriormente transferida eletroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose.

As membranas de nitrocelulose adsorvem proteínas com grande eficiência sendo muito úteis em ensaios QUANTITATIVOS.

A identificação imunológica das frações separadas e transferidas é feita imergindo as tiras de nitrocelulose em solução contendo anticorpos específicos para as frações. Os anticorpos se ligam as frações e são revelados usando uma anti imunoglobulina marcada com uma enzima, para a visualização utiliza-se um CROMOGENO que sob a ação enzimática fornece cor.

TÉCNICA DE WESTERN BLOT

ANÁLISES INSTRUMENTAIS II

SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS

Processo que determina a ordem dos nucleotídeos de uma molécula de DNA. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.

1-) DEGRADAÇÃO QUÍMICA - MAXAM E GILBERT

O alvo deve ser marcado com compostos radioativos FOSFORO 32 (32P) - Decompondo a molécula marcada em pontos específicos - SEM ESPECIFICIDADE

2-) SANGER - DIDESOXI

Mais utilizado por sua SIMPLICIDADE também conhecido como TERMINADORES DE CADEIA OU SANGER

A síntese enzimática de uma fita complementar é INTERROMPIDA pela adição do DIDEOXINUCLEOTÍDEO (NUCLEOTÍDEO TERMINADOR).

METODOLOGIA

Consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo O ÚLTIMO NUCLEOTÍDEO  incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma MARCA que permita detectá-los na etapa de análises. 

SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS

A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA Polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma: dNTPs: dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com 32P sob a forma de análogo ddNTPs.

Estes análogos conhecidos como TERMINADORES quando incorporados à cadeia nascente bloqueará todo o processo.

Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente.

NÃO É UMA METODOLOGIA PRÁTICA, E É UMA TÉCNICA DEMORADA.

MODO AUTOMATIZADO

Através de maquinaria apropriada gerenciada por computadores com programas que têm sequencialmente e identificam os produtos.

Isto permite executar o processo em grande escala.

MARCADOR RADIOATIVO

É usado um marcador radiativo gerando um ALTO CUSTO.

- O analista precisa ter curso IPEM;

- O laboratório deve ter estrutura adequada para trabalhar com radioativo;

- O radioativo é ONCOGÊNICO), não é fácil de trabalhar;

- Precisa-se ter um descarte de lixo especial (LIXO RADIOATIVO).

MARCADOR FLUORECENTE

Utilizam-se 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) por fluorecência.

VANTAGENS: 

- pode-se usar cores diferentes;

- e realizar vários ao mesmo tempo.

Como cada reação (ATGC) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes, realizada em um único canal do gel de sequenciamento.

O sinal fluorecente tem um diferencial, emitindo por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda.

A luz emitida é detectada por "escaneamento" do gel e a sequência deduzida por computador.

ANÁLISES INSTRUMENTAL II

PCR

Reação em cadeia da Polimerase consiste basicamente na amplificação sequencial de fragmentos de DNA PREDETERMINADOS e específicos "in vitro" de um determinado organismo.

Com a PCR, quantidades mínimas de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas, permitindo a detecção rápida de doenças infecciosas através e análises em uma simples eletroforese.

REVISÃO:

DNA - Ácido nucleico composto de duas cadeias antiparalelas complementares. Os nucleotídeos são compostos de um grupo de fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada.

ADENINA      A = T     TIMINA  -     2 PONTES DE HIDROGÊNIO

CITOSINA     C = G     GUANINA -  3 PONTES DE HIDROGÊNIO

DNA

O PCR é uma técnica que amplifica uma sequência especifica de DNA com o objetivo de torná-la abundante e disponível para DIVERSAS TÉCNICAS de biologia molecular.

Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que planqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada a qual pode ser um gene inteiro ou parte dele.

DEFINIÇÕES:

DNA POLIMERASE - enzima

NUCLEOTÍDEOS - monômeros de DNA/RNA

PRIMER - oligonucleotídeos ( aproximadamente 15 a 30 nucleotídeos)

DNA POLIMERASE, PRIMER

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

- DENATURAÇÃO

- ANELAMENTO

- POLIMERIZAÇÃO

MATERIAL

- DNA alvo (template);

- DNA Polimerase;

- Nucleotídeos (DNTP);

- Primer;

- Mg;

- Solução Tampão.

TÉCNICA

PRIMEIRA FASE - DENATURAÇÃO

A dupla fita do DNA da amostra sofre denaturação a temperaturas acima de 94º, gerando duas moléculas de DNA fita simples.

SEGUNDA FASE - ANELAMENTO

Nas 2ª fase 2 primers diferentes hibridizam com sua sequência complementar, localizada em cada uma das fitas de DNA.

TERCEIRA FASE - ALONGAMENTO

Nesta fase a enzima TAQ Polimerase catalisa a adição de nucleotídeos presentes na solução dois primers hibridizados, a uma temperatura de 72º

FASES PCR

APLICAÇÕES:


- Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas;
- Amplificação dos genes para posterior clonagem e expressão;
- Determinação de variabilidade genética;
- Determinação de OGMs;
- Sexagem de embriões;
- Estudo de expressão gênica.

TERMOCICLADOR PCR

VANTAGENS:

- Sensibilidade analítica;

- Detecta organismos que não podem ser isolados;

- Rapidez;

- Versatilidade de amostras.

DESVANTAGENS:

- Contaminação;

- Reprodutibilidade;

- Em alguns casos pouca correlação clínica;

TIPOS DE PCR

1-) RT PCR

Está baseada no processo de transcrição reversa seguida de amplificação. Esta técnica permite a formação de CDNA (DNA complementar) a partir do mRNA. FAZ-SE A ANALISE DE FENÓTIPO, é um modo preventivo não eficaz, pois não consegue identificar a célula alterada. 

Níveis mais alto de sensibilidade são atingidos e o risco de contaminação é menor.

RT PCR

2-) NESTED PCR

O segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo sequências localizadas fora dela e, utilizando-se este primeiro produto, segue-se a amplificação da real sequência alvo. Estas duas etapas podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente. Precisa-se de 4 primers para especificar.

PCR - REAL TIME

Amplificação convencional, baseado DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO sinal fluorecente ao longo dos ciclos. SYBERGREEN/OLIGONUCLEOTÍDEOS marcado com REPORTER (emite fluorecente)  QUENCHER (absorve fluorecente). É adicionado no final de cada ciclo é emitido um sinal fluorecente que é capturado por um sistema óptico e convertido em um gráfico de amplificação.

TÉCNICA QUANTITATIVA

VANTAGENS

- Acompanhamento da reação em tempo real

- Resultados mais rápidos e precisos

- Sistema informatizado

- Permite a detecção de mais de um DNA alvo

- Menor risco de contaminação

- Facilidade quantificação.

ANÁLISES INSTRUMENTAL II

ESPECTROFOTOMETRIA DE EMISSÃO DE CHAMA


A espectrofotometria de emissão de chama baseia-se nas características de emissão de luz por átomos de diversos elementos metálicos quando fornecida energia suficiente, como por exemplo a chama quente.
O comprimento de onda a ser utilizado depende da seleção de uma linha com intensidade suficiente para proporcionar sensibilidade adequada e da ausência de interferência de outras linhas no comprimento de onda.
EX.: 
- lítio - vermelha
- sódio - amarela
- potássio - violeta